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浅谈薄层色谱
点击次数:867 发布时间:2018-01-09
薄层色谱法(thin layer chromatography,TLC)是平面色谱法中应用zui广泛的方法之一,具有分离速度快、灵敏度高、显色方便、操作简便等优点。按分离机理可分为吸附、分配、离子交换、排阻色谱等,应用zui广泛的为吸附薄层色谱法。以下就简单的介绍吸附薄层色谱法。

溶剂极性


 

介绍吸附薄层色谱前,应熟知常用溶剂极性顺序表,便于更好地应用薄层色谱。常用溶剂极性顺序为:石油醚<环己烷<四氯化碳<三氯乙烯<苯<甲苯<二氯甲烷<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<丙酮<正丁醇<乙醇<甲醇<水<乙酸。此外,常见化合物极性顺序为:烷烃<烯烃<醚<硝基化合物<二甲胺<酯类<酮类<醛类<硫醇<胺类<酰胺类<醇类<酚类<羧酸类。


 

 

展开剂选择


 

展开剂的极性越强,其洗脱能力越强,化合物的Rf值越大;反正展开剂极性越小,洗脱能力弱,相应化合物的Rf值越小,一般要求选取合适的展开剂系统使化合物的Rf值控制在0.2-0.8以内。展开剂选择可以用点滴实验法,将要被分离的物质溶液点在薄层板上,挥干,用毛细管分别吸满不同展开剂点到样品点的中心,借毛细管作用,展开剂从圆心向外扩展,出现不同的圆心色谱,选取zui合适的展开剂。如下图,苯为zui合适的展开剂。



 


 

为了提高分离效果,经常需要采用混合溶剂组成流动相,调整比例及更换展开剂组成来调整流动相的极性、互溶性、酸碱性和黏度,达到zui佳的分离目的。混合展开剂中,弱极性溶剂系统一般由石油醚、苯、环己烷等组成,然后选择性加入乙酸乙酯、甲醇、乙醇等;中等极性溶剂系统一般由三氯甲烷和水组成,用乙酸乙酯、甲醇、乙醇来调节,适合于蒽醌类或皂苷类成分分离;大极性溶剂系统一般由正丁醇和水组成,用乙酸乙酯、甲醇、乙醇来调,适合于极性较大的有机碱类化合物的分离。

薄层板的类别


 

常见的薄层板型号及代表含义如下表:


 


 


 

点样


 

点样形状一般为圆形点,点样基线距底边1.0-1.5cm,点样直径为2-3mm,高效板原点直径约为1mm,尽量避免多次点样。点间距离根据斑点扩散情况而定,一般薄层为1-2cm,高效薄层为0.5cm。用手工点样时,应该注意勿损失薄层表明,忌用嘴吹薄层板。


 


 

展开


 

点样后的薄层板,置于密闭的层析缸中展开。展开剂浸入薄层板下端高度不超过0.5cm,保证点样处不接触展开剂。

对于某些复杂或难分离的成分,可采用双向展开法或者二次展开法,双向展开即在方形的薄层板的相邻两边分别划一条直线,相交于一点为原点,将样品溶液点于此点上,先用一种展开剂沿着一个方向展开,吹干展开剂,调转薄层板,再用另一种展开剂进行第二次展开,对复杂难分离的样品有较好的分离效果,如图。


 


 

此外,展开后的板可能会出现边缘效应。边缘效应是指点于同一薄层的同一物质,展开后薄层板边缘处斑点的Rf值与板中间的斑点Rf值有所不同,呈现凹形,如下图。


 


 


 

边缘效应多出现在混合溶剂展开剂系统中,如果薄层板较大,展开时间长,展开剂挥发的速度不同,上行展开时,由于被吸附剂吸附较弱的弱极性或易挥发的溶剂,在薄层板边缘易挥发,使薄层板边缘部分溶剂极性比中间大,边缘斑点的Rf值大于中间区域的;另一方面,薄层板背面蒸气稀薄,导致板边缘处蒸气向背面移动,致使边缘处蒸发掉的溶剂由溶剂贮存器得到补充,板边缘与中心相比,有更多的展开剂沿边缘移动,因此边缘的斑点Rf值高于中间区域。


 

为了减少边缘效应,可采取以下办法:

  1. 使用双槽的层析缸,一槽中放薄层板,另一槽加入展开剂待溶剂蒸气达到饱和后再展开;

  2. 在层析缸内壁贴上浸湿展开剂的滤纸条;

  3. 使用预制板;

  4. 使用较小体积的合适的层析缸;

  5. 将斑点尽量点在靠中间区域;

  6. 采用狭薄层板代替宽薄层板;

  7. 选择适宜的单一展开剂代替混合展开剂;

  8. 采用共沸溶剂代替一般混合溶剂。


 


 

斑点的检识


 

色谱斑点的检识包括光学检出法试剂显色法

光学检出法分三种情况:

  1. 化合物本身有色,在日光下可直接观察;

  2. 化合物在可见光下没有颜色,但可吸收紫外光并发射更长波长的光而呈现不同颜色的荧光斑点;

  3. 在可见紫外光下都不显色,也没有合适显色方法的,可以用荧光薄层板,化合物在紫外灯下可在荧光背景下显示暗斑。这是因为这些化合物减弱了吸附剂中荧光物质的紫外吸收强度,引起荧光猝灭。


 

试剂显色法包括以下三种:

  1. 喷雾显色,将显色剂喷洒于薄层板(硬板)上,根据显色原理不同,可直接显色或加热显色。

  2. 浸渍显色。

  3. 蒸气显色:如碘蒸气,挥发性的酸、碱,如盐酸、硝酸、浓氨水、乙二胺等。


     


 


 

异常斑点的对策


 

7.1 拖尾  

拖尾在薄层中较常见。引起拖尾的原因有以下几点:1.点样过量,由于吸附剂负载样品能力有限,超载的样品被抛在后面,形成拖尾。2.重复点样,重复点样时每次中心未重合,使点样点呈椭圆形,形成拖尾。3.硅胶死吸附大的化合物亦易形成拖尾,如多羟基化合物,有机酸,糖苷等。根据上述原因,浓的样品可以稀释之后再点样;重复点样样品控制手不发抖或者每次点样都控制点在同一位置;加入酸碱等改良剂来减少拖尾现象。


 

7.2 念珠状斑点  

由于化合物斑点之间距离小,相互连接呈念珠状。引起原因有:1.样品成分复杂过多,在短的薄层板上达不到分离效果,彼此重叠。2.重复点样时,中心不重合,形成复斑。采取措施:适当增加薄层板的长度或采用二次双向展开;重复点样时,每次点样中心应重合。


 

7.3 Rf值不稳定  

重复操作时同一样品Rf值不稳定,时高时低。如下情况导致此现象:1.层析稳定不稳定,特别是使用混合展开系统时,温度不稳定导致展开剂比例变化;2.人为操作不当,吸取或加入展开剂时不迅速,或加入展开剂时未及时将层析缸盖上密封;3.薄层板厚薄不均匀;4.溶剂质量不同。对策:如果用电吹风吹干层析缸时一定待层析缸冷却至室温再展开;养成正确的实验操作习惯;选取厚薄均一的薄层板;选择质量好的溶剂。

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